Cel badań/Hipoteza

Celem projektu jest poszukiwanie, wśród roślin z rodziny Oleaceae, związków o potencjalnej aktywności sprzyjającej wygaszeniu stanu zapalnego poprzez zahamowanie infiltracji neutrofili, zahamowanie produkcji cytokin prozapalnych, pobudzenie fagocytozy apoptotycznych neutrofili oraz indukcję wydzielania czynników przeciwzapalnych przez makrofagi. Dobrze udokumentowane tradycyjne zastosowanie roślin z rodziny Oleaceae w terapii chorób o podłożu zapalnym zestawione z ich fitochemiczną różnorodnością pozwala na postawienie hipotezy, że rośliny te mogą być bogatym źródłem nowych interesujących związków o wielokierunkowym działaniu przeciwzapalnym. 

W celu zweryfikowania postawionej hipotezy zostaną przeprowadzone kompleksowe badania fitochemiczne połączone z izolacją aktywnych biologicznie związków. Wnikliwa charakterystyka aktywności biologicznej wyizolowanych związków in vitro i in vivo pozwoli ustalić na poziomie molekularnym ich mechanizm działania przeciwzapalnego.

Metoda badawcza 

Planowane badania będą dotyczyły 32 wyciągów (wodny, 60% etanolowy, dichlorometanowy (DCM)) otrzymanych z różnych części roślin należących trzech rodzajów z rodziny Oleaceae: Fraxinus (1 gatunek), Syringa (1 gatunek) i Forsythia (3 gatunki). Plan prac został podzielony na dwie części: badania fitochemiczne i badania biologiczne. 

Głównym zadaniem części fitochemicznej będzie analiza otrzymanych wyciągów i frakcji metodą HPLC-DAD-MS/MS. Najaktywniejsze wyciągi zostaną podzielone na frakcje o różnej polarności. Z najbardziej aktywnych wyciągów/frakcji, związki odpowiedzialne za zaobserwowaną aktywność zostaną wyizolowane z użyciem metody ‘bio-guided isolation’. 

Badania aktywności biologicznej będą składały się z następujących etapów:

- Wstępna ocena aktywności przeciwzapalnej wyciągów zostanie ustalona w oparciu o zbadanie inhibicji wybuchu tlenowego, uwalniania proteaz (elastaza i MMP-9) i cytokin (IL-8 and IL1β) na modelu ludzkich neutrofili a także wpływ na produkcję cytokin prozapalnych (IL-6 and TNF-α) i przeciwzapalnej IL-10 oraz fagocytozę apoptotycznych neutrofili przez makrofagi otrzymane z linii komórkowej THP-1. Ocena cytotoksyczności wyciągów na obydwóch modelach komórkowych.

- Dla wybranych wyciągów/frakcji wyróżniających się aktywnością zostaną przeprowadzone badania z użyciem szerszego zakresu stężeń. Dodatkowo oznaczony zostanie wpływ na powierzchniową ekspresję cząsteczek adhezyjnych oraz apoptozę neutrofili. Bardziej wnikliwe badania wpływu na produkcję czynników przeciwzapalnych (TGF-β) oraz efferocytozę i fagocytozę zostaną przeprowadzone na makrofagach otrzymanych z linii komórkowej THP-1.  

- Dla przeprowadzenia ‘bio-guided isolation’ dla każdej frakcji zostanie dobrany indywidualnie model, na którym w poprzednich etapach obserwowana była najsilniejsza lub wyróżniająca się aktywność. 

- Wyizolowane aktywne związki zostaną kompleksowo zbadane na pozostałych modelach, co pozwoli wskazać na ich selektywność lub efekt plejotropowy.

- Molekularny mechanizm działania wybranych pojedynczych aktywnych związków zostanie określony poprzez wpływ na szlak NFκB, JAK/STAT, MAPK/ERK i IP3 oraz ekspresję mRNA kodującego oznaczane wcześniej cytokiny (RT-PCR, qRT-PCR)

- Dla wybranych obiecujących związków (1-3) zostanie zbadany wpływ na stan aktywacji układu immunologicznego wywołany nadciśnieniem tętniczym w zwierzęcym modelu doświadczalnym 

Wpływ rezultatów

Wyciągi roślinne zawierające metabolity wtórne będące grupą związków o bardzo różnorodnej budowie chemicznej a za tym generujące dużą ilość farmakoforów o niepowtarzalnej strukturze przestrzennej od dawna były źródłem nowych leków. Dodatkowo związki pochodzenia naturalnego, w odróżnieniu od cząsteczek syntetycznych, ze względu na swoje funkcje biochemiczne w roślinie dają duże szanse na potencjalną interakcje z białkami oraz na zdolność przenikania międzykomórkowego. Obecnie ze względu na gwałtowny rozwój metod fitochemicznych, metabolomiki, modeli biologicznych oraz zracjonalizowaniu selekcji materiału roślinnego, odnotowuje się renesans zainteresowania źródłem naturalnym w poszukiwaniu nowych leków. Niniejszy projekt wpisuje się w trend nowoczesnej farmakognozji/ farmacji i pozwoli na wytypowanie związków o działaniu selektywnym lub plejotropowym mogących zmniejszać objawy chronicznego stanu zapalnego.